Що таке кількісне визначення малеіміду?

Кількість малеіміду розраховується як різниця між початковою кількістю тіолу та кількістю непрореагованого тіолу після повної реакції всіх малеімідних груп. Цей спектрофотометричний аналіз для визначення малеімідних груп є аналізом зворотного GSH.

Модифікація малеїміду передбачає утворення стабільного тіоефірного зв’язку при фізіологічному рН (6,5–7,5) між малеімідною групою, приєднаною до барвника або іншої хімічної групи (наприклад, крослінкера), і вільною сульфгідрильною групою в білку.

Дифункціоналізація малеіміду з дисульфідом і синглетним киснем, що генерується in situ, забезпечує селективне 1,2-тіогідроксилювання в умовах без добавок.. Тут дисульфід відіграє подвійну роль фотосенсибілізатора та сполучного реагенту.

Малеіміди можна безпосередньо аналізувати спектрофотометрично при 302 нм. Однак малий коефіцієнт екстинкції 620 М-1см-1 робить аналіз нечутливим, і аналіз додатково ускладнюється абсорбцією білка на тій же довжині хвилі.

Малеімідні групи зазвичай реагують з тіоловим бічним ланцюгом залишків цистеїну, які демонструють рКа ~ 8,4. Щоб максимізувати специфічність і реактивність цистеїн-малеімідної реакції, зазвичай проводять кон’югації між pH 6,5 і 7,5 (Германсон, 2013).

Малеіміди, пов'язані з ланцюгами поліетиленгліколю, часто використовуються як гнучкі зв'язувальні молекули для прикріплення білків до поверхонь. Подвійний зв’язок легко вступає в ретро-реакцію Міхаеля з тіоловою групою, знайденою на цистеїні, з утворенням стабільного зв’язку вуглець-сірка.

Надлишок малеімідів можна погасити в кінці реакції за допомогою додавання вільних тіолів. EDTA можна включити до буфера зв’язування для хелатування блукаючих двовалентних металів, які інакше сприяють окисленню сульфгідрилів (нереакційноздатних). Схема малеімідної реакції хімічної кон’югації до сульфгідрилу.